肠系膜淋巴结细针抽吸物逆转录酶定量PCR

猫冠状病毒（FCoV）是一种在猫科动物中普遍存在的α冠状病毒。FCoV和该家族中的其他病毒与肠道疾病有关，如雪貂冠状病毒、犬冠状病毒和猪传染性胃肠炎病毒。除了其主要的肠道发病机制外，FCoV还与一种名为猫传染性腹膜炎（FIP）的进行性疾病有关。在大多数情况下，FCoV感染没有明显的临床症状。一部分接触该病毒的猫表现出轻度肠道疾病的症状，通常表现为短暂腹泻，有时伴有呕吐。在大约5%的病例4中，病毒在宿主体内引发异常免疫反应，导致几乎总是致命的脓肿性血管炎，这是FCoV感染的单核细胞外渗的结果。FIP被认为是由一系列的陈述组成，一端是渗出型，另一端是非渗出型。近年来，渗出性FIP的诊断取得了很大进展。从体腔收集渗出液样本是一种微创兽医干预措施。本研究的目的是评估MLNFNA联合FCoVRTqPCR的诊断潜力。作为初始步骤，将该方法的灵敏度与MLN活检（MLNBs）的RT-qPCR进行比较。在一项前瞻性研究中，然后使用来自以下几组猫的样本分析MLNFNAFCoVRTqPCR的特异性：（1）FCoV血清阴性；（2）血清阳性但无FIP迹象（或已确认其他疾病/死亡原因）；（3）FIP病例。MLNFNA样品提交给格拉斯哥大学兽医诊断服务（VDS）也被评估，以确定是否从野外诊所提交的未保存（即，盐水）样品是合适的，从而评估是否转运到实验室对测试灵敏度产生不利影响。对该方法的敏感性、特异性和诊断准确性进行了全面评估。

临床样本:

来自8例FIP病例的样本用于初步研究（T组）。然后，主要研究包括20只非渗出性FIP猫（D组）、8只血清阳性无FIP猫（P组）和18只血清阴性无FIP猫（N组）的第二个对照组；Table1提供了这三组样本来源的详细信息。

技术路线:

结果:

1.用于FCoVqRTPCR检测的MLNFNA的可行性

一组匹配的MLNFNA和MLNB来自8只确诊为FIP（T01-T08）的猫。从FNA制剂中回收的RNA量在3至ng/μL之间变化，而从MLNB制剂中回收的RNA量在至ng/μL之间变化（补充材料1）。平均而言，FNA比MLNB制剂回收的RNA浓度低35倍，差异较大。进行RT-qPCR以评估FNA和MLNB制剂中宿主（GAPDH）和病毒RNA的存在。在每个FNA和MLNB制剂中检测到FCoVRNA，以及宿主编码RNA的存在。总体而言，MLN-FNA反应的宿主基因和病毒基因的Ct值略高，表明模板核酸水平较低。MLNFNAFCoVCt值范围为19.4–36.1，而MLNBFCoV的范围为18.0–28.1，在每个配对样本中记录的MLNBFCoVCt值较低。样本类型之间的FCoVCt值关系如图Fig.1所示。对于MLNFNA制剂，GAPDHCt值与总RNA浓度（r=?0.87，P0.01），与预期一致。然而，FCoVCt值与总RNA浓度（r=?0.61，P=0.11）。因此不能得出结论，模板病毒RNA（即病毒载量）的水平完全取决于总RNA的浓度，其中大部分由宿主编码。

2.野外采集的MLNFNA中RNA的活性

由于GAPDHRT-qPCRCt值显示与RNA浓度密切相关并且依赖于可行的宿主RNA，因此这些值被用作RNA样本质量的指标，包括数量和完整性。将在大学制备/收集的32个MLNFNA样本的GAPDHCt值与外部兽医诊所通过邮件提交的12个样本进行比较，以检查在运输过程中是否存在潜在的RNA退化（补充材料2）。内部Ct值的中位数为25.8，而外部样本的Ct值仅略高，为28.4，因此可以得出结论，在新鲜样本和邮寄样本中发现了同样高水平的RNA。

3.MLN-FNA-FCoVRT-qPCR检测的敏感性和特异性

用RT-qPCR检测18/20只非弥漫性FIP猫（D组）的FCoV。两种提取物均未检测到FCoVRNA，但均含有充足的参考基因RNA，因此检测灵敏度为90%。有趣的是，这些样本代表了该组中唯一的FIP神经病例，并且发现这种关联具有统计学意义（P=0.）。FCoVCt值在22.7和38.2之间变化，与GAPDHCt值呈中度相关性（r=0.72，P0.01）。这种关系如图Fig.2所示。在研究中没有FIP的26只猫（对照组P和N）中，仅在一只猫中检测到FCoV，因此总体检测特异性为96.1%。在实践中，FCoV血清阴性状态往往会排除FIP的诊断，因此该检测与非FIP血清阳性猫的队列特别相关；该组的特异性为87.5%。Ct值为23的阳性样本来自猫P04，随后被诊断为化脓性支气管肺炎。通过免疫组织化学分析来自肾、肺、肝和脾的切片，但在所检查的任何组织中均未检测到FCoV抗原。生成了一个2×2列联表，以评估MLNFNART-qPCR检测与FIP标准诊断工具相比的性能。结果表明，评估者之间的一致性很高，几乎是完美的（κ=0.88；95%CI0.75–1.0）。

结论：

这项研究的结果表明，MLN的FNA的FCoVRT-qPCR是帮助诊断非渗出性FIP的有用工具。该检测可以检测确诊FIP病例的MLNFNA中的FCoV，而不能检测血清阴性猫和大多数没有FIP的FCoV血清阳性猫的样本中的FCoV。虽然识别FIP神经系统病例的能力有限，但当应用于可疑的“经典”系统性FIP病例时，该测试非常敏感。由于该技术的侵入性远低于传统活检并提供有用的诊断信息，因此它代表了对FIP当前诊断方法套件的有用补充。编辑：张成琪预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇