脐带间充质干细胞移植治疗终末期肝硬化的疗

0引言

肝硬化是一种或多种原因引起的肝脏损害，因缺乏有效的根治措施，发展至终末期肝硬化时，患者常出现严重的低蛋白血症、大量顽固性腹水、反复发作的肝性脑病等；有效的治疗方法为肝移植，但由于供体不足、耗资巨大等而难以普遍开展。近年来，间充质干细胞移植已成为治疗终末期肝硬化的新方向。骨髓间充质干细胞应用于临床较早，但抽取骨髓为有创性检查，增加了患者痛苦及治疗风险，而脐带间充质干细胞具有来源丰富，无创操作等特点，故越来越多的学者致力于研究脐带来源的间充质干细胞。任红英等[1]研究证实脐带间充质干细胞在体外可分化为有功能的肝细胞样细胞且具有低免疫原性特征。作者选择60例终末期肝硬化患者，采用肝动脉插管进行脐带间充质干细胞移植，以观察脐带间充质干细胞治疗终末期肝硬化的疗效及安全性。

1对象和方法

设计：细胞培养，临床治疗观察疗效。

时间及地点：于/医院中心实验室及消化科完成。

对象：选择/医院消化科住院患者60例。其中男35例，女25例，年龄29~73岁，平均(57.97±13.57)岁，诊断参照年病毒性肝炎防治方案诊断标准，病毒性肝炎后肝硬化47例(78%)、酒精性肝硬化7例(17%)、隐原性肝硬化3例(5%)、原发性胆汁性肝硬化3例(5%)。

纳入标准：

①临床诊断为肝硬化失代偿期(Child-PughB级、C级)患者。

②要求脐带间充质干细胞移植治疗并签署知情同意书。

排除标准：

①肝癌或其他部位肿瘤。

②大量应用抗病毒药物患者。

③有自发性腹膜炎及其他部位感染患者。

脐带标本：

医院妇产科足月顺产胎儿脐带，脐带间充质干细医院医学伦理委员会同意，标本采集均征得家属及产妇同意，细菌、支原体、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、梅毒、艾滋病、内毒素检测均阴性。

治疗方法：

在X射线透视下，采用Seldinger法经股动脉穿刺肝固有动脉插管，对比剂注射，观察肝脏无占位性病变，用微量泵将脐带间充质干细胞泵入肝动脉(约4h)，泵完后给予10mL生理盐水冲管，术后插管侧下肢制动24h，行肝动脉插管术后常规护理，预防性抗生素应用3d。细胞移植后，患者需要服用抗病毒药物及利尿剂；如有需要补充血浆，白蛋白及凝血酶原复合物患者，用药频率应与移植前相同，如患者恢复良好，应尽量避免补充上述药物。

主要观察指标：

2，4，8，12周分别检测血清白蛋白、前白蛋白、总胆红素水平及凝血酶原时间、纤维蛋白原水平，并观察患者症状、体征及有无不良反应。

统计学分析：

用SPSS17.0软件分析数据，计数资料应用x±s表示，两组治疗前后比较用配对t检验，P≤0.05为差异有显著性意义。

2结果

2.1参与者数量分析60例患者均能按时进行复查，移植后2，4，8，12周进行白蛋白、前白蛋白、总胆红素、凝血酶原时间、纤维蛋白原监测。按意向性处理分析。

2.2移植技术成功率及不良反应60例患者均成功插管，移植成功率%中无发热、寒战、呼吸困难、静脉炎等，无股动脉穿刺部位渗血，未发生与移植相关的严重并发症。

2.3脐带间充质干细胞移植后各项指标的检测结果见表1。

结果提示，移植后2周肝功能及凝血功能指标开始好转，凝血酶原时间、总胆红素水平较移植前明显下降，血清白蛋白、前白蛋白、纤维蛋白原水平较术前明显上升，各项指标移植前后比较，差异有显著性意义(P0.05)。

2.4脐带间充质干细胞移植后症状、体征改善情况

移植后2周食欲、精神、体力开始改善，12周时改善明显，改善率分别为92%(55/60)、93%(56/60)和83%(50/60)，腹水消失52例(87%)，下肢水肿消失52例(87%)。

3讨论

间充质干细胞是一种具有自我更新能力和扩增的细胞，可以从很多组织中提取，如骨髓、脂肪组织、脐带血、胎儿、肺、肾脏、妊娠中期的羊水组织，大量存在于骨髓、胚胎、脐血、脐带。它可以在诱导条件下分化为不同的细胞种类，包括肝细胞、脂肪细胞、肌细胞、神经细胞等[2-3]。应用于临床治疗损伤修复性疾病，如肝硬化、骨折、帕金森病等[4]。

干细胞治疗肝硬化应具备以下特点：可在体外大量扩增并保持未分化状态，没有致瘤性；细胞体积可以穿过肝细胞窦；低免疫原性；具有向肝细胞分化的潜能。采用临床分娩废弃的脐带经处理后，可获得大量的间充质干细胞，取材方便，来源广，数量充足，长期传代分化少，干/祖细胞更原始，增殖能力强，没有致瘤性，病毒、病原微生物感染及传播能力较低，不违背医学伦理道德。

间充质干细胞无致瘤性，张颢等[5]将脐带间充质干细胞的细胞悬液(含有个原始间充质干细胞)和K细胞各0.5mL分别均匀滴在铺有底层琼脂的平皿，37℃体积分数为5%CO2培养箱中培养，每隔1周取出，显微镜观察是否有克隆形成。结果示培养2周后，K组可见明显的克隆形成，而脐带间充质干细胞未见克隆形成，表明脐带间充质干细胞无致瘤性。

间充质干细胞具有低免疫原性和免疫抑制作用，细胞移植后不会产生免疫排斥反应[6-8]。间充质干细胞通过与调节性T细胞(regulatoryTcell，Treg)、B细胞等通过复杂的作用机制维持免疫耐受。Treg是一类具有负性免疫调节的细胞，Lanni等[9]证明，间充质干细胞能诱导Treg生成，维持Treg的免疫抑制功能，从而达到间接的免疫调节。间充质干细胞能抑制B细胞的增生。Corcione等[10]将人骨髓间充质干细胞与B细胞共培养，发现B细胞停滞于Gn/G期，表明间充质干细胞抑制B细胞的增殖，另外，间充质干细胞还能通过自然杀伤细胞、树突状细胞等进行免疫抑制作用[11-12]。间充质干细胞分泌可溶性分子，通过可溶性分子抑制T细胞的免疫调节作用从而达到间接抑制[13]。

间充质干细胞移植为肝硬化患者带来了希望，移植后促进了肝脏再生，在肝脏修复中起着重要作用[14-15]，很多研究表明，间充质干细胞能改善患者的肝功能。Yu等[16]分别应用肝细胞生长因子、表皮细胞生长因子及两者联合应用以诱导骨髓间充质干细胞，结果示各组细胞形态均由长梭形变为类圆形或多角形，诱导第7、14天甲胎蛋白、白蛋白mRNA均呈阳性表达，证明肝细胞生长因子、表皮细胞生长因子以及二者联合均具有诱导人骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的能力。Agarwal等[17]诱导间充质干细胞向肝细胞分化的过程中发现，诱导成熟后的细胞表达CD26、ALB、Cyp3A4、Cyp7A1等肝细胞特异性标志，表明间充质干细胞在诱导条件下可分化为肝细胞。Parekkadan等[18]将间充质干细胞与肝星状细胞共同培养时，发现间充质干细胞产生的白细胞介素10和肝细胞生长因子可促使肝星状细胞分泌白细胞介素6，从而促进肝细胞的再生，减少胶原蛋白的沉着，减少了肝硬化程度。Vanpoll等[19]发现用受损肝细胞诱导小鼠间充质干细胞，小鼠间充质干细胞可以分化为肝实质细胞，并表达甲胎蛋白、清蛋白和CK19等肝细胞基因的特有产物。Lange等[20]在体外用含有胎肝细胞的体系中培养间充质干细胞，发现间充质干细胞可表达白蛋白、细胞角蛋白18和甲胎蛋白mRNA等肝特异性基因，而单独培养间充质干细胞，则不会有肝特异性基因的表达；在培养3周后，由于胎肝细胞的过度生长，间充质干细胞失去了表达肝特异性基因的能力。Wan等[21]用右旋氨基半乳糖诱导小鼠制成急性肝损伤小鼠模型，用间充质干细胞条件培养基输注到该小鼠全身，发现90%的凋亡肝细胞减少，并有大量的肝细胞再生，表明间充质干细胞有促进肝细胞再生及抑制肝细胞凋亡的作用。

脐带间充质干细胞治疗可明显提高终末期肝硬化患者的症状，血总胆红素水平、凝血酶原时间明显下降，白蛋白、前白蛋白及纤维蛋白原升高，腹水明显减少，提高了患者的生活质量，减轻了患者需长期应用药物治疗的经济负担，有广阔的临床应用前景。需要注意的是，本文选择病例均在有效控制病毒量、自发性腹膜炎、有效治疗大量腹水等前提下进行移植，为干细胞进入人体后提供较好的生长环境。

另外，间充质干细胞移植后有一定[22]提高细胞的归巢率能提高移植效率，怎样的归巢率，提高细胞的归巢率也成为下一步研究的方向。间充质干细胞的研究对肝病患者是新的希望，对于研究者来说还需要大量细致的探索研究。

4参考文献

[1]RenHY,ZhaoQJ,XingW,etal.ZhongguoYixueKexueyuanXuebao.;32(2):-.

任红英,赵钦军,邢文,等.脐带间充质干细胞体外分化为有功能的低免疫原性肝细胞样细胞[J].中国医学科学院学报,,32(2):-.

[2]ChaoKC,ChaoKF,FuYS,etal.Islet-likeclustersderivedfrommesenchymalstemcellsinWhartonsJellyofthehumanumbilicalcordfortransplantationtocontroltype1diabetes.PLoSOne.;3(1):e.

[3]HaiderM,CappelloJ,GhandehariH,etal.Invitrochondrogenesisofmesenchymalstemcellsinre







































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